|
|
Aktivace protinádorové imunitní odpovědi s pomocí bispecifických fúzních proteinů
Chytrá, Gabriela ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Přirozené zabíječské buňky (NK buňky) jsou lymfocyty vrozeného imunitního systému, které rozeznávají a eliminují transformované, potenciálně škodlivé, buňky v mechanismu zvaném imunitní dohled. Maligně transformované buňky se snaží imunitnímu dohledu uniknout a v případě že uspějí, dojde k rozvoji rakovinného onemocnění. Pro obnovení imunitního rozpoznávání maligních buněk lze použít imunoterapii na bázi NK buněk využívající terapeutické bispecifické fúzní proteiny. Terapeutické fúzní proteiny cílí tumorové markery exprimované na povrchu maligních buněk a zároveň stimulují imunitní odpověď prostřednictvím vazby na aktivační receptor NK buněk, např. receptor NKG2D nebo NKp30. Relevantním příkladem tumorového markeru je HER2 receptor, který je často nadměrně exprimován u několika typů nádorových onemocnění a zejména u karcinomu prsu. Tato práce popisuje přípravu několika bispecifických fúzních proteinů s potenciálním využitím v imunoterapii. Bispecifické fúzní proteiny sestávají z aktivačního ligandu NK buněk (ligand MICA nebo B7-H6) a nanoprotilátky cílící vybraný tumorový marker (HER2 receptor), které jsou spojeny flexibilní glycin-serinovou spojkou. Konstrukty těchto fúzních proteinů byly připraveny ve dvou prostorových uspořádáních - s nanoprotilátkou situovanou na N-konci a ligandem na C-konci a...
|
|
|
Targeting mitochondria to overcome resistance of breast cancer to therapy
Rohlenová, Kateřina ; Neužil, Jiří (vedoucí práce) ; Špíšek, Radek (oponent) ; Vítek, Libor (oponent)
(CZ) Nádory jsou heterogenní a sestávají z několika buněčných populací. Populace buněk, se schopností iniciovat nádor je známá jako rakovinné kmenové buňky (RKB). Rakovinné buňky s kmenovými vlastnostmi a se zvýšenou rezistencí k protirakovinné léčbě, jsou nejvíce postiženy při zásahu do mitochondriální respirace, což koncept RKB spojuje s deregulovanou bioenergetikou. V souladu s tím bylo prokázáno, že funkční elektron transportní řetězec (ETC) je nezbytný pro vznik nádoru. Exprese onkogenu HER2 v rakovině prsu je spojována s rezistencí k léčbě a byla též spojena s regulací mitochondriální funkce. Proto jsme zkoumali možnost, zda manipulací s mitochondriální bioenergetikou prostřednictvím narušení ETC je možné eliminovat buněčné populace rezistentní vůči zavedené léčbě, jako jsou RKB a buňky exprimující HER2. Zjistili jsme, že buňky a nádory s vysokou expresí HER2 vykazují zvýšenou respiraci přes komplex I a mají více respiračních superkomplexů (SK). Tyto buňky jsou citlivé k látce MitoTam (mitochondriálně cílený derivát tamoxifenu), která působí jako inhibitor komplexu I a narušuje SK. MitoTam překonává rezistenci k tamoxifenu a snižuje metastatický potenciál buněk s vysokou expresí HER2. Zvýšená citlivost buněk exprimujících HER2 k látce MitoTam je závislá na mitochondriální frakci HER2. Další...
|
|
|
Studium interakce receptoru NKp46 s adhesinem Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Jednou ze složek nespecifického imunitního dohledu organismu jsou NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky). Úkolem NK buněk je vyvolat apoptosu u cílových buněk (například buněk rakovinných či virově infikovaných). Cílové buňky jsou rozpoznávány pomocí povrchových receptorů. NK buňky mají na svém povrchu aktivační a inhibiční receptory. Mezi aktivační receptory patří receptor přirozené cytotoxicity NKp46. Jedním z několika dosud popsaných ligandů tohoto receptoru je adhesin Epa1 (z angl. epithelial adhesin 1) kvasinky Candida glabrata. Neschopnost těla spustit imunitní odpověď a bránit se kvasinkové infekci způsobuje vážné komplikace u pacientů s hematologickým onemocněním, tzv. invazivní kandidózy. NK buňky se začínají využívat také v rámci imunoterapie nádorů, konkrétně bispecifické fúzní proteiny, které se jednou částí váží na receptor NK buňky a druhou částí na nádorový antigen. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantního proteinu NKp46. Pro studium vlivu O-glykosylace na vazbu ligandu byl připraven mutant glykosylačního místa NKp46 T225A. Proteiny byly produkovány stabilně transfekovanými liniemi HEK293S GnTI- a HEK293T. Protein Epa1 byl produkován v expresním systému E. coli a poté purifikován. Schopnost vazby proteinu Epa1 a laktosy byla ověřena pomocí dvou...
|
|
|
The Role of Tyrosine Kinase Activity of Mitochondrial ERBB2/HER2 in Breast Cancer
Novotná, Eliška ; Rohlena, Jakub (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Rakovina prsu je častým nádorovým onemocněním postihující miliony žen po celém světe. Amplifikace onkogenu HER2 v rakovině prsu sice umožňuje nasazení cílené terapie, nicméně až u třetiny pacientek dochází k vytvoření rezistence vůči léčbě. Jeden z možných mechanismů rezistence může být relokalizace HER2, receptoru s tyrosinkinázovou aktivitou, z plazmatické membrány do mitochondrií. Nicméně mechanismus působení mitochondriální frakce HER2 zřejmě nevyužívá kanonickou signalizaci HER2 umístěného v plazmatické membráně. Mitochondriální HER2 zvyšuje energetický metabolismus rakovinných buněk, proliferaci a migraci v několika in vitro modelech a tvorbu nádorů v myších spojenou se zvýšenou produkcí ROS. Mitochondriální HER2 je kinázově aktivní, a já jsem se proto zabývala rolí kinázové aktivity v jeho funkci. Kinázová aktivita mitochodnriálního HER2 podporuje některé vlastnosti potřebné v tumorigenezi, ale konstitutivní kinázová aktivita způsobila zvýšenou citlivost buněk k buněčné smrti a zpomalila růst nádorů v myším modelu. Na druhé straně, mutace v ATP-vazebném místě HER2, s níž je HER2 kinázově neaktivní, zvýhodnila buňky v růstu bez možnosti adheze a v tvorbě nádorů in vivo. Lze proto navrhnout, že mitochondriální funkce onkogenu HER2 je závislá nejen na jeho kinázové aktivitě, ale také zahrnuje...
|
|
|
Studium vlivu N-vázané glykosylace na funkci nanoprotilátky cílící receptor HER2
Chytrá, Gabriela ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Nádorová onemocnění jsou v současnosti velmi rozšířená a jejich kompletní léčba vyžaduje eliminaci všech nádorových buněk v organismu. Jedním ze způsobu léčby je imunoterapie, která se snaží vyvolat imunitní odpověď a aktivovat tak protinádorové obranné mechanismy organismu. K tomu se používají terapeutické protilátky, které cílí markery na nádorových buňkách. Jeden z těchto markerů je receptor HER2, jehož exprese je zvýšená například na povrchu nádorových buněk karcinomu prsu. Jako terapeutické protilátky se často používají humanizované monoklonální protilátky, ale používají se i jiné konstrukty, jako jsou bispecifické částice, nanoprotilátky či jejich analogy. Nanoprotilátkami se označují rekombinantní variabilní domény odvozené od protilátek, které ve své struktuře postrádají lehké řetězce. V přírodě se takové protilátky přirozeně vyskytují například u savců z čeledi velbloudovití nebo u některých paryb, jako jsou žraloci. Tato práce popisuje přípravu různých glykoforem nanoprotilátky antiHER2 a ověření vlivu této glykosylace na vazbu nanoprotilátky na povrch buněčné linie exprimující na svém povrchu receptor HER2. Byla připravena nanoprotilátka s komplexní přirozenou glykosylací (produkovaná v buněčné linii HEK293T) a nanoprotilátka s homogenní glykosylací (produkovaná v buněčné linii HEK293S...
|
|
|
Studium interakce receptoru NKp46 s adhesinem Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Jednou ze složek nespecifického imunitního dohledu organismu jsou NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky). Úkolem NK buněk je vyvolat apoptosu u cílových buněk (například buněk rakovinných či virově infikovaných). Cílové buňky jsou rozpoznávány pomocí povrchových receptorů. NK buňky mají na svém povrchu aktivační a inhibiční receptory. Mezi aktivační receptory patří receptor přirozené cytotoxicity NKp46. Jedním z několika dosud popsaných ligandů tohoto receptoru je adhesin Epa1 (z angl. epithelial adhesin 1) kvasinky Candida glabrata. Neschopnost těla spustit imunitní odpověď a bránit se kvasinkové infekci způsobuje vážné komplikace u pacientů s hematologickým onemocněním, tzv. invazivní kandidózy. NK buňky se začínají využívat také v rámci imunoterapie nádorů, konkrétně bispecifické fúzní proteiny, které se jednou částí váží na receptor NK buňky a druhou částí na nádorový antigen. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantního proteinu NKp46. Pro studium vlivu O-glykosylace na vazbu ligandu byl připraven mutant glykosylačního místa NKp46 T225A. Proteiny byly produkovány stabilně transfekovanými liniemi HEK293S GnTI- a HEK293T. Protein Epa1 byl produkován v expresním systému E. coli a poté purifikován. Schopnost vazby proteinu Epa1 a laktosy byla ověřena pomocí dvou...
|
|
|
Studium biomarkerů karcinomu prsu po neoadjuvantní léčbě.
Skálová, Helena ; Povýšil, Ctibor (vedoucí práce) ; Kolář, Zdeněk (oponent) ; Křen, Leoš (oponent)
Chemoterapie je jednou základních léčebných modalit karcinomu prsu, která chirurgickému odstranění nádoru může předcházet a/nebo jej následovat jako součást neoadjuvantní resp. adjuvantní léčby. Selekční tlak chemoterapie na nádorové buňky však může vést ke změně jejich molekulárního a expresního profilu a následně i chemosenzitivity a zásadně tak ovlivnit další průběh léčby. Cílem této práce bylo zmapovat změny v expresi vybraných markerů v karcinomu prsu po neoadjuvantní chemoterapii, které by mohly přispět k porozumění, jakou roli tyto proteiny a geny sehrávají při odpovědi nádoru na léčbu a vzniku chemorezistence. Imunohistochemická analýza exprese standardních markerů karcinomu prsu [estrogenových (ER) a progesteronových receptorů (PR), HER2 a proliferační aktivity (Ki67)] a proteinů mezibuněčných spojů (claudinů 1, 3 a 4, E- a N-cadherinu) před a po neoadjuvantní chemoterapii odhalila pokles exprese PR, Ki67 a claudinu 3 a zvýšení exprese claudinu 1. Exprese ER, HER2, claudinu 4, E- a N-cadherinu se významněji nezměnila. Stanovení exprese standardních markerů je součástí rutinního bioptického vyšetření vzorků karcinomu prsu a je nezbytné pro indikaci léčby. Naše výsledky podporují současná doporučení pro opakování vyšetření před indikací adjuvantní chemoterapie. Claudiny a cadheriny se...
|
|
|
The Role of Tyrosine Kinase Activity of Mitochondrial ERBB2/HER2 in Breast Cancer
Novotná, Eliška ; Rohlena, Jakub (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Rakovina prsu je častým nádorovým onemocněním postihující miliony žen po celém světe. Amplifikace onkogenu HER2 v rakovině prsu sice umožňuje nasazení cílené terapie, nicméně až u třetiny pacientek dochází k vytvoření rezistence vůči léčbě. Jeden z možných mechanismů rezistence může být relokalizace HER2, receptoru s tyrosinkinázovou aktivitou, z plazmatické membrány do mitochondrií. Nicméně mechanismus působení mitochondriální frakce HER2 zřejmě nevyužívá kanonickou signalizaci HER2 umístěného v plazmatické membráně. Mitochondriální HER2 zvyšuje energetický metabolismus rakovinných buněk, proliferaci a migraci v několika in vitro modelech a tvorbu nádorů v myších spojenou se zvýšenou produkcí ROS. Mitochondriální HER2 je kinázově aktivní, a já jsem se proto zabývala rolí kinázové aktivity v jeho funkci. Kinázová aktivita mitochodnriálního HER2 podporuje některé vlastnosti potřebné v tumorigenezi, ale konstitutivní kinázová aktivita způsobila zvýšenou citlivost buněk k buněčné smrti a zpomalila růst nádorů v myším modelu. Na druhé straně, mutace v ATP-vazebném místě HER2, s níž je HER2 kinázově neaktivní, zvýhodnila buňky v růstu bez možnosti adheze a v tvorbě nádorů in vivo. Lze proto navrhnout, že mitochondriální funkce onkogenu HER2 je závislá nejen na jeho kinázové aktivitě, ale také zahrnuje...
|
|
|
Příprava fúzních domén lidských imunoreceptorů pro jejich využití v imunoterapii
Cmunt, Denis ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Jednou z funkcí imunitního systému je imunitní dohled nad nádorově transformovanými buňkami, tedy schopnost takové buňky odstranit dříve, než se mohou stát škodlivými pro organismus. V případě, že se transformovaným buňkám podaří imunitnímu dohledu uniknout, dochází k rozvoji onkologického onemocnění. Nádorová imunoterapie spočívá v cílené stimulaci imunitního systému v boji proti nádoru. V poslední době se projevuje zájem o využití NK buněk v imunoterapii nádorů. Tyto buňky, patřící k nespecifické imunitě, se podílejí na imunitním dohledu. Při setkání s cílovou buňkou rozhoduje o aktivaci NK buňky integrace signálu z jejích povrchových aktivačních a inhibičních receptorů, které vážou ligandy na povrchu cílové buňky. V případě, že dojde k aktivaci NK buňky, spouští proti cílové buňce cytotoxickou odpověď. Využití NK buněk v imunoterapii zahrnuje mimo jiné testování bispecifických fúzních proteinů, které mohou jednou částí vázat povrchový nádorový antigen a druhou částí NK buněčný aktivační receptor, čímž zprostředkují kontakt obou buněk a vyvolají cytotoxickou odpověď. Tato práce představuje přípravu bispecifických fúzních proteinů sestávajících z aktivačního ligandu MICA (pro receptor NKG2D), nebo B7H6 (pro receptor NKp30) a nanoprotilátky cílící jeden ze tří nádorových antigenů HER2, CD20 a FGFR....
|
|
|
Příprava fúzních ligandů a ověření jejich vazby na NK buněčné receptory
Nepokojová, Tereza ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent)
NK buňky (z angl. natural killers - "přirození zabíječi") jsou důležitou součástí přirozené imunity. Na svém povrchu nesou komplexní skupinu receptorů, které používají různé signalizační motivy k aktivaci nebo k inhibici. NK buňky jsou schopny cíleně zabíjet aberantní buňky, tedy virové, infikované a nádorové buňky, pomocí speciálních cytotoxických mechanismů, kterými vyvolají apoptózu. Mezi aktivační receptory patří také receptory NKG2D, rozeznávající ligand MICA, a NKp30, který rozeznává ligand B7-H6. Pro imunitní systém člověka je tedy přirozené, že rakovinné buňky jsou ničeny pomocí NK buněk. Současné terapeutické cíle v léčbě nádorových onemocnění se zaměřují především na posilování vlastní přirozené schopnosti těla bojovat proti rakovině a je k tomu využíváno právě NK buněk. Vedle NK buněk jsou také nejen k léčbě rakoviny hojně využívány protilátky. Z velké části se jedná o monoklonální protilátky, avšak v současné době začínají být hojně využívané také fragmenty protilátek. Tato práce pojednává o přípravě tří bifunkčních fúzních proteinů: B7-H6-L-aHER2, MICA-L-aHER2 a aHER2-L-MICA, které obsahují imunoligandy aktivačních receptorů NK buněk a VHH fragment antiHER2 protilátky, v linii lidských embryonálních ledvinných buněk HEK293T. Proteiny byly úspěšně připraveny a dále byla ověřena vazba na...
|
host ::
RSS.